دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم و تحقیقات آیت ا…آملی

گروه : زیست شناسی

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد “M.Sc.”

 

عنوان:

بررسی اثر ضد قارچی نانو کیتوزان و برخی از داروهای آزولی

به صورت منفرد و در ترکیب با هم بر روی مخمرهای مهم پزشکی

 

استاد راهنما

دکتر فاطمه زابلی

 

استاد مشاور:

دکتر مازیار شریف زاده

 

تابستان 93

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

                                                             فهرست مطالب

  عنوان                                                                                                                       صفحه

چکیده……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1         

فصل اول: کلیات تحقیق ……………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-1-.مقدمه ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 3

1-2- نانوتکنولوژی …………………………………………………………………………………………………………………………… 5

1-2-1- مفهوم و کاربردها …………………………………………………………………………………………………………………. 5

1-2-2- مزایا استفاده از نانو ذرات …………………………………………………………………………………………………….. 6

1-2-3- کاربردهای نانوذرات در دارورسانی ………………………………………………………………………………………. 6

1-2-4- حمل داروهای ضد عفونت …………………………………………………………………………………………………… 7

1-3- نانو ذرات کیتوزان ……………………………………………………………………………………………………………………. 7

1-3-1- کیتین و کیتوزان ………………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-3-1-1- تاریخچه تولید کیتوزان …………………………………………………………………………………………………….. 9

1-3-1-2-.کاربردهای کیتوزان ………………………………………………………………………………………………………….. 9

1-3-1-2-1-. خو.اص ضد میکروبی کیتوزان ……………………………………………………………………………………. 10

1-3-2- انواع روش های تولید نانوذرات کیتوزان…………………………………………………………………………………. 10

1-3-2-1- روش ژل شدن یونی…………………………………………………………………………………………………………. .           10

1-3-2-2- روش جداسازی فازی در محیط آب با بهره گرفتن از روش رسوب دهی…………………………………….. 11

1-3-2-3- روش امولسیون ترسیبی…………………………………………………………………………………………………….. .11      

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

1-3-2-4- روش میسل معکوس…………………………………………………………………………………………………………. 12       

1-3-3- تعیین مشخصات نانو ذرات……………………………………………………………………………………………………. 12       

1-3-3-1- میکروسکوپ الکترونی……………………………………………………………………………………………………… 12       

1-3-3-2- دستگاه دی ال اس(زتا سایزر)…………………………………………………………………………………………… 13       

1-4- بیماریهای قارچی فرصت طلب…………………………………………………………………………………………………… 14       

1-4-1- کاندیدا آلبیکنس…………………………………………………………………………………………………………………… 14

1-4-1-1- مورفولوژی و شناسایی………………………………………………………………………………………………………. 15

1-4-1-2- پاتولوژی………………………………………………………………………………………………………………………….. 16

1-4-2- کاندیدا گلابراتا…………………………………………………………………………………………………………………….. 17

1-4-2-1- موفولوژی و شناسایی………………………………………………………………………………………………………… 18

1-4-2-2- پاتولوژی………………………………………………………………………………………………………………………….. 19

1-4-3- مالاسزیا فورفور……………………………………………………………………………………………………………………. 19

1-4-3-1- موفولوژی و شناسایی………………………………………………………………………………………………………… 20

1-4-3-2- پاتولوژی………………………………………………………………………………………………………………………….. 21

1-5- داروهای ضد قارچی و مکانیسم اثر آنها………………………………………………………………………………………. 21

1-5-1- مکانیسم داروهای ضد قارچی………………………………………………………………………………………………… 22

1-5-1-1- مکانیسم اثر ترکیبات آزول و عوارض………………………………………………………………………………… 23

1-5-1-2- فلوکونازول………………………………………………………………………………………………………………………. 23       

1-5-1-2-1-فعالیت ضد قارچی فلوکونازول در آزمایشگاه…………………………………………………………………… 23

 

عنوان                                                                                                                           صفحه

1-5-1-2-2- جذب فلوکونازول………………………………………………………………………………………………………… 24       

1-5-1-2-3-توزیع و جذب فلوکونازول…………………………………………………………………………………………….. 24

1-5-1-2-4- متابولیسم و دفع فلوکونازول………………………………………………………………………………………….. 24

1-5-1-2-5- اثرات جانبی فلوکونازول………………………………………………………………………………………………. 24

1-5-1-2-6- اشکال دارویی فلوکونازول……………………………………………………………………………………………. 25

1-5-1-2-7- مصارف کلینیکی فلوکونازول…………………………………………………………………………………………. 25

1-5-1-3- کتوکونازول……………………………………………………………………………………………………………………… 25

1-5-1-3-1- فعالیت ضد قارچی کتوکوکازول در آزمایشگاه………………………………………………………………… 25

1-5-1-3-2- جذب کتوکونازول……………………………………………………………………………………………………….. 26

1-5-1-3-3- متابولیسم و حذف کتوکونازول………………………………………………………………………………………. 26

1-5-1-3-4- اثرات جانبی کتوکونازول……………………………………………………………………………………………… 26

1-5-1-3-5- اشکال دارویی کتوکونازول……………………………………………………………………………………………. 27

1-5-1-3-6- مصارف کلینیکی کتوکونازول………………………………………………………………………………………… 27

1-5-2- مکانیسم مقاومت دارویی……………………………………………………………………………………………………….. 27

1-6- اندازه گیری فعالیت داروهای ضد قارچی در شرایط آزمایشگاهی………………………………………………….. 30

1-6-1- انواع تست های حساسیت داروئی………………………………………………………………………………………….. 31

1-6-2- روش های استاندارد تست های حساسیت داروئی ………………………………………………………………….. 33

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده …………………………………………………………………………………………….. 35

فصل سوم:مواد و روش ها …………………………………………………………………………………………………………………… 41

 

عنوان                                                                                                                          صفحه

3-1- تهیه مواد و ابزارها در تولید نانوذرات کیتوزان……………………………………………………………………………… 42

3-2- تولید نانو ذرات کیتوزان…………………………………………………………………………………………………………….. 43       

3-2-1- تهیه سود یک مولار………………………………………………………………………………………………………………. 43

3-2-2- تهیه محلول تری پلی فسفات سدیم………………………………………………………………………………………… 43

3-2-3- تهیه محلول استوک کیتوزان…………………………………………………………………………………………………… 43

3-2-4-تهیه نانو ذرات کیتوزان به روش ژلی شدن یونی……………………………………………………………………….. 43

3-2-5- استفاده از دستگاه دی ال اس………………………………………………………………………………………………… 44       

3-3- دستگاه ها و مواد مورد استفاده در تعیین حساسیت داروئی…………………………………………………………… 45

3-4- آماده سازی محیط کشت……………………………………………………………………………………………………………. 46

3-4-1- تهیه محیط سابرود دکستروز آگار…………………………………………………………………………………………… 46

3-4-2- تهیه محیط سابرود دکستروز براث………………………………………………………………………………………….. 46

3-4-3- تهیه محیط دیکسون آگار تغییر یافته……………………………………………………………………………………….. 47

3-4-4- تهیه محیط دیکسون براث تغییر یافته……………………………………………………………………………………… 47

3-5- ارگانیسم های مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………….. 48

3-5-1- تهیه کلنی کاندیدا آلبیکنس،کاندیدا گلابراتا،مالاسزیا فورفور بر روی محیط جامد……………………….. 48

3-5-1-1- تهیه سوسپانسیون از آمپول لیوفلیزه……………………………………………………………………………………. 48

3-5-1-2- انتقال سوسپانسیون مخمری به محیط کشت جامد……………………………………………………………….. 48

3-5-1-3- تهیه کشت تازه و ساب کالچر…………………………………………………………………………………………….. 49       

3-5-1-4- بررسی میکروسکوپی مخمرها با لاکتو فنل کاتن بلو…………………………………………………………….. 49

 

عنوان                                                                                                                          صفحه

3-6- انجام تست حساسیت دارویی ……………………………………………………………………………………………………. 49

3-6-1- تهیه سوسپانسیون قارچی………………………………………………………………………………………………………. 49

3-6-2- تهیه محلول دارویی……………………………………………………………………………………………………………….. 50

3-6-3- تهیه محلول نانو ذرات کیتوزان………………………………………………………………………………………………. 51

3-7- انجام تست حساسیت دارویی از طریق MIC………………………………………………………………………………. 51

3-7-1- تعیین حساسیت مخمرهای مذکور نسبت به فلوکوناوزل،کتوکوناوزل،و نانو کیتوزان…………………….. 51

3-7-2- تعیین حساسیت مخمری مذکور نسبت به ترکیب نانو کیتوزان با داروهای آزمون………………………… 52

3-8- خواندن نتایج MIC………………………………………………………………………………………………………………….. 52       

3-8-1- خواندن نتایج MIC از طریق چشمی……………………………………………………………………………………… 52

3-8-2- خواندن نتایج MIC از طریق دستگاه الایزا ریدر……………………………………………………………………… 53

3-9- نتیجه گیری و مقایسه داده ها……………………………………………………………………………………………………… 53

فصل چهارم: نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………. 54

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………71

پیشنهادات: ………………………………………………………………………………………………………………………………………..79

فهرست منابع فارسی: …………………………………………………………………………………………………………………………80

فهرست منابع انگلیسی:…………………………………………………………………………………………………………………………82

چکیده انگلیسی:………………………………………………………………………………………………………………………………….89

 

                                                            فهرست جداول

عنوان                                                                                                               صفحه

فصل سوم:مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………………………. 41

جدول(3-1) دستگاه‏های مورد استفاده در تولید نانو کیتوزان………………………………………………………………….. 42

جدول(3-2) مواد مورد نیاز در سنتز نانو کیتوزان………………………………………………………………………………….. 42

جدول(3-3) دستگاه‏های مورد استفاده در تعیین حساسیت داروئی…………………………………………………………. 45

جدول(3-4) محیط کشت‏های مورد استفاده………………………………………………………………………………………….. 45

جدول(3-5) مواد شیمیایی مورد استفاده………………………………………………………………………………………………. 46

جدول(3-6) مخمرهای مورد استفاده در آزمایش…………………………………………………………………………………… 48

فصل چهارم:نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………. 54

جدول(4-1) نتایج اندازه گیری سایز نانو کیتوزان…………………………………………………………………………………. 55

جدول(4-2) نتایج حاصل از اندازه گیری پتانسیل زتا نانو ذرات کیتوزان………………………………………………… 56

جدول(4-3) شمارش تعداد CFU مخمرهای آزمون در برابر داروی فلوکونازول………………………………………. 58

جدول(4-4) تعیین میزان MIC50 و MIC90 داروی فلوکونازول در برابر مخمرهای مورد آزمون……………. 58

جدول(4-5) شمارش تعداد کلنی مخمرهای در برابر کتوکونازول…………………………………………………………… 59

جدول(4-6) تعیین میزان MIC50 و MIC90 داروی کتوکونازول در برابر مخمرهای مورد آزمون……………. 59

جدول(4-7)شمارش تعداد کلنی های CFU مخمرهای آزمون در برابر نانو کیتوزان………………………………….. ..60

جدول(4-8)تعیین میزان MIC50 و MIC90داروی نانو کیتوزان در برابر مخمرهای آزمون……………………… .60

جدول(4-9) شمارش تعداد کلنی CFU مخمرهای آزمون در برابر اثر ترکیب نانوکیتوزان و فلوکونازول…….. 61

جدول(4-10) تعیین میزان MIC50 و MIC90ترکیب نانو کیتوزان و فلوکونازول در برابر مخمرهای آزمون 61

جدول(4-11)شمارش تعداد کلنی CFU مخمرهای مورد آزمون در اثر ترکیب نانو کیتوزان و کتوکونازول….. 62

جدول(4-12)تعیین میزان MIC50 و MIC90ترکیب نانو کیتوزان و کتوکونازول در برابر مخمرهای آزمون. 62       

 

عنوان                                                                                                                       فهرست

جدول(4-13) نتایج آزمون آنالیز واریانس برای مقایسه تعداد کلنی مخمرهای مورد آزمون در حضور داروهای مختلف به صورت تکی و در ترکیب…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

جدول(4-14) نتایج آزمون آنالیز واریانس برای مقایسه تاثیر داروها بر مخمرهای آزمون…………………………… 67

جدول(4-15) مقایسه تعداد کلونی در غلظت های مختلف ترکیب نانو کیتوزان با گروه شاهد ………………….. 68

جد.ول(4-16) مقایسه تعداد کلونی در غلظت های مختلف ترکیب نانو کیتوزان و فلوکونازول با گروه شاهد. 69

جد.ل4-17)مقایسه تعداد کلنی در غلظت های مختلف ترکیب نانو کیتوزان و کتوکونازول با گروه شاهد…….. 70
                                     فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                 صفحه

نمودار(4-1) محدوده جذب برای کاندیدا گلابراتا………………………………………………………………………………… 57

نمودار(4-2) محدوده جذب برای کاندیدا آلبیکنس……………………………………………………………………………….. 57

نمودار(5-2)محدوده جذب برای مالاسزیا…………………………………………………………………………………………….. 57
                                       فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                  صفحه

فصل اول:کلیات………………………………………………………………………………………………………………………………… 2

شکل(1-1)تبدیل کیتین به کیتوزان………………………………………………………………………………………………………. 8

شکل(1-2) واکنش بین کیتوزان و تری پلی فسفات سدیم……………………………………………………………………… 11

شکل(1-3) موفولوژی کاندیدا آلبیکنس………………………………………………………………………………………………… 16

شکل(1-4) موفولوژی کاندیداگلابراتا…………………………………………………………………………………………………… 18

شکل(1-5)موفولوژی مالاسزیا فورفور………………………………………………………………………………………………….. 20

فصل سوم:مواد و روش‏ها…………………………………………………………………………………………………………………….. 41

شکل(3-1) مراحل تولید نانو کیتوزان…………………………………………………………………………………………………… 44

شکل(3-2) الف:اولتراسونیک ب:زتا سایزر ج:فریز درایر……………………………………………………………………….. 44

شکل(3-3) محیط کشت مورد استفاده………………………………………………………………………………………………….. 47

شکل(3-4) محلول های داروئی در رقت های مورد نیاز…………………………………………………………………………. 50

شکل(3-5) میکروپلیت های 96 خانه ای……………………………………………………………………………………………… 52

شکل(3-6) خواندن میکروپلیت 96 خانه ای توسط دستگاه الایزا ریدر………………………………………………….. 53

شکل(3-7) پلیت های مخمرهای مورد آزمایش……………………………………………………………………………………… 53

 

چکیده:

زمینه و هدف: با توجه به مقاومت مخمرهای بیماریزا به انواع آنتی بیوتیک ها و عوامل ضد میکروبی مرسوم،تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی موثر انجام شده است.هدف مطالعه حاضر تعیین فعالیت ضد قارچی نانو ذرات کیتوزان در حالت منفرد و در ترکیب با داروهای آزولی بر علیه برخی از مخمرهای مهم پزشکی می‏باشد..

روش بررسی:در این مطالعه تجربی قارچ‏‏های کاندیدا آلبیکنس(ATCC5027)،کاندیدا گلابراتا(ATCC5297) و مالاسزیا فورفور(MF1) به عنوان میکروارگانیسم‏های مورد آزمایش استفاده شدند.نانو ذرات کیتوزان با بهره گرفتن از روش ژلاسیون یونی تولید شد و با بهره گرفتن از دستگاه زتا سایز اندازه سایزو پتانسیل زتا آن اندازه گیری شد..فعاالیت ضد قارچی نانو ذرات و داورهای فلوکونازول و کتوکونازول یه صورت منفرد و در ترکیب با بهره گرفتن از تعیین حداقل غلظت مهار کننده رشد(MIC)به روش میکرو دایلوشن در دو محیط کشت سابررد دکستروز براث (برای همه قارچ به جز مالاسزیا)و دیکسون براث تغییر یافته (برای مالاسزیا)مورد بررسی قرار گرفت و مقادیرMIC50,و MIC90برای هر یک از ترکیبات بر اساس شمارش تعداد کلنی قارچی در مقایسه با گروه شاهد محاسبه شد.میزان شاخض غلظت مهاری (FIC) برای تعیین یا توضیح بر هم کنش نانو ذرات در حالت ترکیب با داروها مورد آزمایش استفاده گردید.و نتایج با بهره گرفتن از آزمون آنالیز واریانس و آزمون دانکن با سطح معنی داری 05/0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

یافته ها: قطر نانو ذرات تولید شده در بررسی‏ها‏ی صورت گرفته در محدوده 251 نانومتر قرار دارد.نتایج نشان داد که نانو کیتوزان و داروهای مذکور از طریق وابسته به غلظت قادر به مهار رشد عوامل قارچی می باشند.به طوری که میزان MIC  داروی فلوکونازول برای کاندیدا آلبیکنس،کاندیدا گلابراتا و مالاسزیا فورفور به ترتیب برابر 16-128،4-64،4-32،میکروگرم در میلی لیتر و میزان MIC داروی کتوکونازول به ترتیب برابر،2-16،8-32،4-32 میکروگرم در میلی لیتر و میزان MIC نانو کیتوزان به ترتیب برابر،256-1024،512-1024،1024-4096 ،میکروگرم در میلی لیتر تعیین شد.و شاخص غلظت مهاری تنها در ترکیب نانو کیتوزان وفلوکونازول برابر با 1 و در بقیه ترکیبات بالاتر از 2 تعیین شد.نتایج حاصل ازشمارش کلنی ها  نسبت به گروه شاهد در هر یک از ترکیبات معنی دار بود (P<0.05).          

نتیجه گیری:طبق نتایج ذرات تولید شده در محدوده نانو قراردارد.همچنین این ذرات  دارای اثر ضد قارچی بر علیه مخمرهای مورد آزمایش در غلظت های مختلف بود.و بهترین عملکرد را بر روی مخمرهای کاندیدا آلبیکنس و کاندیدا گلابرتا داشت.و در حالت ترکیبی تنها ترکیب نانو کیتوزان و فلوکونازول بر روی مخمر کاندیدا گلابرتا اثر افزاینده و در سایر حالت ها بی اثر بوده است.

واژه های کلیدی:

 نانو کیتوزان،کتوکونازول،فلوکوناوزل ،ژلاسیون یونی،میکرودایلوشن، مخمرهای بیماری زا

      

فصل اول

  کلیات

 

1-1-مقدمه

در سالهای اخیر،عفونت‏های سیستمیک [1] قارچ‏ها که به وسیله مخمر[2]های بیماریزا ایجاد شده است،از مهم ترین عوامل مرگ و میر بخصوص در بیماران بستری در بیمارستان بوده است.پاتوژن[3] های فرصت طلب مهم مانند کاندیدا آلبیکنس[4] و سایر گونه‏های کاندیدا در این میان نقش بسزایی دارند.هر چند کاندیدا آلبیکنس به عنوان یک بیماریزای فرصت طلب دهانی،همچنان فراوان‏ترین گونه‏های جدا شده نسبت به سایر عوامل قارچی است(قهفرخی و همکاران،1387)،اما سایر گونه‏های کاندیدا در بیماران با نقص سیستم ایمنی سبب ایجاد عفونت‏های سیستمیک می‏شوند.همچنین کاندیدا گلابراتا[5] یکی از شایع‏ترین گونه‏هایی است که در سطح بدن یافت می‏شود و دفعتا از پوست و ادرار جدا می‏گردد.این گونه را به عنوان یکی از عوامل فرصت طلب بیماری‏‏‏های قارچی و احشایی انسان می‏دانند(الیسا و همکاران،[6]2007).عفونت‏های سیستمیک ناشی از کاندیدا در بیماران مبتلا به ایدز افزایش چشمگیری داشته است.اینگونه عفونت‏ها اصولا با داروهای آزولی[7] بویژه فلوکونازول[8] درمان می‏شوند(البارگونگا و همکاران،2010)[9].اما درمان طولانی و تکراری سبب ظهور و پیدایش ایزوله های مقاوم به فلوکونازول در میان گونه های کاندیدا شده است و درمانهای رایج با بهره گرفتن از داروهای ضد قارچی متداول کاملا موثر نمی‏باشد؛این امر به دلیل اثرات متعدد جانبی و مقاومت دارویی به عوامل پاتوژن پس از استفاده طولانی مدت از دارو می‏باشد(نوذری و همکاران،2012)[10].

مالاسزیا فوفور[11]از گونه‏های مهم جنس مخمری مالاسزیا است که به عنوان فلور طبیعی پوست انسان مطرح است.این قارچ در بیمارهای مختلف،شامل شوره سر،درماتیت سبوره[12]و سپتی‏سمی[13]های ناشی از مصرف کاتتر[14]های آلوده به این قارچ دخیل است.عفونت های سطحی ناشی از گونه‏های مالاسزیا به ویژه مالاسزیافورفور معمولا به درمان به خوبی پاسخ نمی‏دهند و عودهای مکرر دارند.کتوکونازول[15] یکی از مشتقات ضد قارچی آزولی است که در درمان پی‏تی‏ریازیس ورسیکالر[16] ناشی از مالاسزیا مورد استفاده قرار می‏گیرد(مطهری نیا و همکاران،1390).تحقیقات نشان می‏دهد که اشکال مختلفی از داروهای ضد قارچی ترکیبی مورد آزمایش قرار گرفته‏اند که در برابر  برخی از قارچهای بیماریزا اثرات هم افزایی خوبی را نشان می‏دهند(قعفرخی و همکاران،1387)،از سویی پیشرفت‏های مهمی در علم نانو[17] در جهت تولید داروهای ضد قارچی با عوارض کمتر و اثر بخشی بهتر در سالهای اخیر صورت گرفته است.نانو کیتوزان[18] یک پلیمر کاتیونیک طبیعی است که در اثر حرارت دادن کیتین در هیدروکسید سدیم حاصل می‏شود.این ذرات به دلیل داشتن خواصی مانند زیست سازگاری،زیست تخریب پذیری،مخاط چسبی، غیر سمی و هیدورفیل بودن بطور گسترده‏ای در سیستم های جدید انتقال دارو[19] مورد استفاده قرار گرفته‏اند(پارک و همکاران،2010[20]).

کیتوزان بدلیل ویژگیهای فیزیکوشیمیایی و بیولوژیکی بی نظیرش،انگیزه‏های بسیاری را برای توسعه سالم و موثر سیستم دارورسانی برانگیخته است.اتصال شیمیایی دارو به کیتوزان از طریق گروه‏های عاملی می‏تواند پیش داروهای سودمندی تولید کند.این پلیمر طبیعی در تحویل داروهای مختلف استفاده می‏شود(حسین زاده و همکاران،[21]2012).همچنین فعالیت ضد میکروبی نانو کیتوزان و مشتقات آن در مقابل گروه‏های مختلف میکروارگانیسم[22] ها مثل باکتری‏ها،قارچ‏ها و مخمرها وابسته به وزن مولکولی متوسط و قابلیت آنها به تجزیه آنزیمی و رها شدن الیگومر[23]های محلول در آب است.اثرضد میکروبی نانو کیتوزان ناشی از گروه های آمینی با بار مثبت است.این گروه‏ها با غشای سلولی میکروارگانیسم‏ها منجر به نشت اجزای پروتئینی و نیز اجزای درون سلولی میکروارگانیسم‏ها می‏شود(وینسوا و همکاران2011)[24]در این پروژه ابتدا نانو ذرات کیتوزان با بهره گرفتن از روش ژلاسیون یونی[25] تولید و پس از تعیین اندازه و شکل ذره فعالیت ضد قارچی آن در فضای آزمایشگاه با بهره گرفتن از روش میکرودایلوشن[26] به طور مجزا و در ترکیب با داروهای ضد قارچی فلوکونازول و کتوکونازول مورد بررسی قرار می‏گیرد.

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

 

قیمت : 14700 تومان

***

و  همچنین به ایمیل شما نیز ارسال می شود.

:                 [email protected]

 

جستجو در سایت : کلمه کلیدی خود را وارد نمایید :